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集成微流控单细胞免疫印迹芯片实现循环肿瘤细胞的高通量分离、富集和直接蛋白质分析

学术动态    2022-07-21 17:04

 

DOI: 10.38/s41378-021-00342-2

 

对单个循环肿瘤细胞(CTC)的有效捕获和分析有助于肿瘤的早期诊断和个性化治疗。然而,由于其极低的丰度和对其他细胞干扰的敏感性,在一个完整的系统中进行高通量分离、富集和单细胞水平的功能蛋白分析仍然是一个主要的挑战。上海交通大学丁显廷教授团队提出了一种集成的多功能微流控系统,用于高效和无标记的CTC分离、富集和单细胞免疫印迹(ieSCI)。

 

ieSCI-chip 是一个集成的多层微流体系统,允许对捕获的 CTC 进行高效、无标记的 CTC 分离、富集和单细胞免疫印迹;应用 ieSCI 芯片来监测每个单独的肿瘤细胞对顺铂治疗的药物反应。ieSCI-chip 成功识别出来自顺铂处理的凋亡阴性(Bax 阴性)细胞亚组,而传统的批量分析掩盖了这一亚组。这一发现为顺铂治疗通常会诱导肿瘤细胞凋亡的固有智慧提供了新的见解;展示了 ieSCI 芯片与乳腺癌患者血液样本的临床应用,用于个性化 CTC 上皮间质转化 (EMT) 分析。值得注意的是,这有助于证明 CTCs 诊断系统的实际工作台侧到床侧转化应用的可用文献非常少。

 

图1 (a) ieSCI 芯片操作程序的概述和示意图:i) 基于锯齿形通道的无标记和高效细胞分选,以从红细胞耗尽样品中的背景白细胞中分离 CTC;  ii) 膜辅助 CTC 纯化和富集;  iii) 倒转芯片后,重力诱导的 CTC 沉降到聚丙烯酰胺凝胶上的微孔中;  iv) 在定制的电泳室中,CTC 的化学裂解和释放的蛋白质的电泳分离;  v) 通过长波长紫外线照射对分离的蛋白质进行凝胶内光固定;  vi) 用一抗进行免疫印迹,用二抗进行荧光标记。  (b) ieSCI 芯片操作程序的时间表。

图2 (a) 10 μm 和 24 μm PS 颗粒相对于内通道壁的流速和平衡位置的关系。(b) 在分叉处获得的高速显微镜图像表明 10 μm 和 24 μm PS 颗粒的分离。(c) 在流速为 1.4 mL/min 的四个时间点,位置 4 处的颗粒分布,表明大颗粒在通道中心附近流动,而小颗粒 (10 μm) 则沿着通道壁流动。(d) 流式细胞术结果的散点图,显示了初始样品、内部出口和外部出口中颗粒(10 μm 和 24 μm)的比例。(e) 每个出口的粒度分布。数据表示为平均值 ± SD(SD,标准偏差,n = 3)值。(f) 在分叉处获得的高速显微镜图像表明 WBC 和 MCF-7 细胞的分离。(g) 流式细胞术结果的散点图,显示从初始样本、内出口和外出口收集的细胞组成。(h) 每个出口的细胞纯度。

 

图3 (a) 芯片制造过程中经过不同处理的凝胶中 BSA 迁移行为的代表性荧光图像(左图)和定量比较(右图)。  ns 表示不显着。  (b) 柱状图显示分离分辨率 (SR) 随着凝胶孔径的减小而提高。  (c) 左图:未处理细胞和顺铂处理的 Bax 阳性细胞的单细胞免疫印迹结果的代表性图像。右图:对照和顺铂处理的细胞之间的 Bax 表达分布。将每个单细胞中的 Bax 信号标准化为相应的 β-微管蛋白信号(对照,n = 25 个细胞;顺铂处理,n = 27 个细胞)。  E = 40 V cm-1,裂解时间 = 10 秒,电泳时间 = 25 秒,12% T mPyTC-PA 凝胶)。蓝色矩形表示 Bax 阴性顺铂处理的细胞。  ( d )对照(CTL)和顺铂处理(处理)的MCF-7细胞中Bax和β-微管蛋白表达的常规蛋白质印迹图像(上图)和定量比较(下图)。