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上海市第六人民医院范存义&欧阳元明:ADSC接种rGO/PCL各向异性支架的制备及其在周围神经再生中的应用

学术动态    2022-07-07 16:58

DOI: 10.1016/j.bioactmat.2022.05.034

 

缓慢的再生速度和错误的轴突生长是影响周围神经修复疗效的主要问题。通过神经支架进行生物物理干预可以为神经再生提供有效、可调节且可持续的指导。在此,研究者通过静电纺丝技术制造了以各向异性超细纤维和定向纳米槽为特征的还原氧化石墨烯(rGO)/聚己内酯(PCL)支架。在体外将脂肪源性干细胞(ADSCs)接种在支架上,并研究其活性、神经分化效率和神经营养潜力。RGO/PCL导管重新编程种子细胞的表型并有效修复大鼠15mm坐骨神经缺损。总之,神经支架上的生物物理线索是干细胞表型的关键决定因素,而ADSC接种rGO/PCL定向支架是实现周围神经再生的有希望、可控且可持续的方法。

 

图1.神经导管制备与表征的示意图。(A)静电纺丝超细纤维从静电纺丝机的注射器中喷出,并沿其纵轴沉积在管状模具上。定向超细纤维用纳米槽修饰,所制备的支架用于细胞接种和神经修复。(B)支架的光学和SEM图像。支架内外表面形态的放大。纳米槽和rGO纳米颗粒(红色)呈现在PCL超细纤维(绿色)上。

 

图2.神经导管的形态、力学性能和导电性。(A)0.25%、0.5%、0.75%、1%、2%和4%rGO/PCL超细纤维的SEM图像和所有组超细纤维的直径分布。比例尺:10μm。(B-E)2%rGO/PCL和PCL电纺膜的支架厚度(B)以及包括弹性模量(C)、断裂伸长率(D)和润湿性(E)在内的力学性能比较。(F)2%rGO/PCL和PCL支架的应力-应变曲线。(G)2%rGO/PCL和PCL的BET表面积。P和P0分别为N2在77K时的平衡压力和饱和压力。STP是标准温度和压力。(H)不同rGO含量的rGO/PCL支架的电导率。(I)PCL和2%rGO/PCL电纺薄膜的TGA曲线。ns:无显著差异。

 

图3.rGO颗粒、rGO/PCL薄膜和PCL薄膜的表征。(A)rGO样品的TEM图像。比例尺:50nm(左)和10nm(右)。(B)rGO样品的EDS图谱。(C)rGO样品的HRTEM图像和相应的元素映射。比例尺:250nm。(D)rGO、PVP、rGO/PCL和PCL的FTIR光谱。(E)rGO、rGO/PCL和PCL的拉曼光谱。(F)rGO/PCL和PCL纤维膜的三维AFM图像。(G)rGO/PCL纤维膜的XPS光谱。(H)rGO/PCL和PCL纤维膜的XRD分析。(I)rGO/PCL和PCL纤维膜的EDS。比例尺:20μm。

 

图4.ADSCs的存活、生长和神经分化以及DRG神经元在支架上的神经突发育。(A)通过CCK8测定法分析第1、2、3和4天ADSCs的增殖。与PCL支架比较,*p<0.05。与0.25%rGO/PCL支架比较,▴p<0.05。与0.5%rGO/PCL支架比较,●p<0.05。与0.75%/PCL支架比较,⋄p<0.05。与1%rGO/PCL支架比较,■P<0.05。与4%rGO/PCL支架比较,#p<0.05。(B-C)流式细胞仪定量细胞凋亡。PI反映细胞的晚期凋亡或死亡。Annexin-V揭示了细胞的早期凋亡。(D)rGO/PCL和PCL支架上的细胞生长形态。细胞排列和附着是纵向取向的。比例尺:分别为50μm和15μm。(E-F)ADSCs中两种神经营养因子的蛋白质印迹定量分析。(G)在分化培养基中培养7天后,通过Tuj1(绿色)和GFAP(红色)免疫荧光确认ADSCs的神经元和胶质细胞分化。比例尺:100μm。(H)与ADSCs共培养3天的DRG神经元的NF200荧光染色。比例尺:100μm。(I)GFAP和Tuj1阳性细胞的定量分析。(J)用ADSCs培养的DRG神经元平均神经突长度的定量分析。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns:无显著差异。

 

图5.FACS急性分离ADSCs的RNA测序,确定PI3K-Akt信号传导是rGO诱导ADSC重编程的关键调节因子。(A)通过FACS从再生神经桥中分离和纯化表达GFP的ADSCs的示意图。(B)基于GFP表达水平的ADSC纯化的代表性FACS图。无GFP表达的对照ADSCs用于门控。(C)将来自PI3K和FA信号的差异表达基因列为热图。(D)rGO/PCL和PCL组之间上调基因的KEGG通路富集分析可视化。点的大小表示上调DEGs的相对数量。(E)LY294002处理后,rGO/PCL支架上ADSCs的MBP和NGF表达显著降低。(F)rGO/PCL和PCL导管的ADSCs的RNA测序差异基因表达分析。调控基因的表达量达到2倍以上的变化(adj.p<0.05)以红色和绿色突出显示。(G)MBP、NGF和p-Akt的定量分析显示,通过蛋白质印迹测量,在LY294002处理后,这些蛋白质的表达分别降低了约2.425、3.885和2.436倍。**p<0.01,***p<0.001。

 

图6.术后18周损伤神经功能重建及全身毒性分析。(A)rGO/PCL、PCL和自体移植组在手术后第18周的大鼠步行足迹。(B)从步行足迹分析计算的SFI值。(C)根据每组的电生理测试计算DCMAP和NCV。(D)电生理测试示意图,其中电极放置在再生神经的近端和远端。(E)每组的代表性电生理记录。(F)主要功能器官的HE染色。比例尺:100μm*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns:无显著差异。

 

图7.不同支架和自体移植组再生坐骨神经的体内形态学分析。(A)再生坐骨神经的TB染色。比例尺:50μm。(B)有髓神经纤维平均密度的定量分析。(C)术后18周再生神经的TEM图像。放大图像显示不同组的髓鞘和轴突,第一、二、三行的比例尺分别为10μm、2μm和1μm。(D-E)髓鞘厚度和轴突横截面积的定量分析。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns:无显著差异。

 

图8.不同支架和自体移植组术后18周再生神经的代表性免疫荧光图像。(A)再生神经的MBP(绿色)和Tuj1(红色)免疫荧光染色。比例尺:100μm和10μm。(B)再生神经的S100β(绿色)和NF200(红色)免疫荧光染色。最左边和其余列的比例尺为100μm和10μm。(C-F)MBP、Tuj1、NF200和S100β的神经标志物表达区域的定量分析。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns:无显著差异。

 

图9.各组FG逆行追踪和脊髓响应。(A)FG示踪剂注射以及在相应脊髓DRGs和前角累积的示意图。(B)在不同组的运动神经元和DRG感觉神经元中观察到免疫荧光示踪剂。第一列和第二列是FG标记的脊髓的免疫荧光图像。第三列是相应的脊髓光学照片。最后一列是FG标记的DRGs的免疫荧光图像。脊髓的比例尺为300μm。DRG的比例尺为150μm。(C)三组中FG标记的运动神经元和DRG感觉神经元的定量分析。(D)三组中巢蛋白和GFAP相对表达水平的定量分析。(E)不同组脊髓的巢蛋白(绿色)和GFAP(红色)神经标志物的免疫荧光染色。比例尺分别为500μm(左)和50μm(右)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,ns:无显著差异。

 

图10.不同组的血管生成和肌肉神经再支配性能以及rGO/PCL和PCL导管的体内PI3K-Akt信号通路研究。(A)CD31免疫化学染色显示再生神经中的新血管。比例尺:100μm。(B)CD31表达区域的定量分析。(C)大鼠再生腓肠肌的马松三色染色。比例尺:200μm。(D)对每组平均Pm的定量分析。(E)rGO/PCL和PCL导管再生神经的Akt和p-Akt染色。比例尺:200μm(左)和50μm(右)。(F-G)rGO/PCL和PCL组中p-Akt和Akt表达水平的定量分析。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

 

 

图11.电活性各向异性神经支架的应用及微环境修复的基本机制示意图。(A)拓扑线索、电活性rGO纳米粒子和生物线索的整合导致了载有细胞的rGO/PCL定向支架的产生。(B)载有ADSC的神经支架体内植入后表现出神经引导性能。(C)ADSCs模拟了Büngner带的结构并在神经微环境中发挥神经营养作用。(D)神经支架中的RGO纳米颗粒有效地触发了PI3K-Akt信号,而拓扑线索激活了ADSCs内的FA信号。这两种信号通路协同作用于干细胞表型的重编程以促进神经再生。