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四川大学华西口腔医学院赵志河:3D仿生PCL/PLA/CNTs电纺支架的制备及其在颞下颌关节盘再生中的应用

学术动态    2022-06-06 16:36

DOI: 10.1016/j.actbio.2022.05.008

 

截至目前,颞下颌关节紊乱病(TMD)仍然是一个巨大的临床挑战,其发病率高,但治疗方法有限且不稳定,仅姑息性治疗方法可用。颞下颌关节盘(TMJD)是最易受损伤的部位之一,其微观结构复杂、纤维软骨分布的区域特异性以及再生能力差进一步阻碍了其功能再生。为了解决上述问题,本研究采用通用且相对简单的静电纺丝(ELS)技术成功制造了一种仿生三维聚(ε-己内酯)(PCL)/聚丙交酯(PLA)/碳纳米管(CNTs)盘形支架,其双凹大体解剖结构和区域各向异性微观结构再现了原生关节盘的结构。体外结果验证了最佳CNTs增强仿生支架具有优异的力学、生物活性和再生性能,并进一步进行了体内实验。验证了该支架在裸鼠皮下植入模型中的生物相容性和异位纤维软骨形成性后,原位证实了兔TMJD缺损区域中支架引导的关节盘再生和软骨下骨保护作用,这意味着形态学线索在接触诱导组织再生中起着关键作用。总之,本工作代表了复杂、非均质组织工程的重大进步,为顽固性TMD疾病提供了有希望的临床解决方案。

 

图1.3D纳米仿生颞下颌关节盘(TMJD)支架的制作。(A-B)具有双凹形状和定向纤维排列的原生TMJD的解剖结构。(C)制作3D纳米仿生TMJD支架的示意图。(D)3D纳米仿生TMJD支架的大体图像。

 

图2.2D电纺纳米纤维垫的表征。(A)电纺垫的表面形态。比例尺:50um。(B,C)纤维直径分布和垫子的角度。(D)具有不同CNTs比率的定向垫子的特征应力-应变曲线。(E)具有相同碳纳米管比例但不同纤维排列的两组垫子的特征应力-应变曲线。(F)每组垫子的抗拉强度的定量结果。(G)垫子的杨氏模量。随机或定向纳米纤维垫分别定义为RD或AL,不同的百分比表示添加了相应的碳纳米管(CNTs)。(每组n=3,平均值±SD;与有或无CNTs的RD组相比,*P<0.05;与所有其他组相比,#P<0.05;与其他组相比,&P<0.05)

 

图3.3D支架的表征。(A)3D支架的横截面形态。(B)环形纤维的微观形态。(C)3D纳米仿生TMJD支架的内部结构。(D)3D支架的压缩应力-应变曲线。(E)3D支架的压缩应力。(F)3D支架的弛豫模量。(每组n=3,平均值±SD;与所有其他组相比,&P<0.05。随机或定向纳米纤维垫分别定义为RD或AL,不同百分比表示添加了相应的CNTs)

 

图4.大鼠骨髓基质细胞(rBMSCs)形态、分布和增殖活性。(A,B)不同2D垫或3D支架上rBMSCs的扫描电子显微镜(SEM)和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像。(C,E)接种后rBMSCs在2D垫子或3D支架上的增殖活性。(每组n=6,平均值±SD;与对照组相比,*P<0.05;与所有其他组相比,#P<0.05;与其他组相比,&P<0.05)。(D,F)不同2D垫子或3D支架上的细胞定向分布。

 

图5.支架上rBMSCs的纤维软骨相关蛋白和基因表达。(A,B)纤维软骨细胞培养4周后细胞-支架复合物的免疫荧光染色:聚集蛋白聚糖(AGG)(红色)、F-肌动蛋白和I型胶原蛋白(COL-1)(绿色)以及细胞核(蓝色)。(C-E)第7天细胞-支架复合物基因表达的实时PCR分析:聚集蛋白聚糖、COL1A1和MMP-13。(每组n=3,平均值±SD;与对照组相比,*P<0.05;与所有其他组相比,#P<0.05;与其他组相比,&P<0.05)

 

图6.支架植入4个月后兔TMJD缺损区纤维软骨再生的形态学、组织学和免疫组化分析。(A)TMJD缺损构建、原位支架植入和固定过程的示意图及术中图像。(B)支架植入4个月后修复的TMJ关节盘的大体形态图像。(C)每组的代表性苏木精和伊红(H&E)染色图像。比例尺:500μm。(D)每组的代表性番红O-固绿染色图像。比例尺:50μm。(E,F)免疫组化染色评估各组COL-1和AGG的表达。比例尺:100μm。(G)每组中新形成纤维的角分布。(a)用番红O-固绿染色的天然TMJ关节盘;比例尺:50μm。(b)角度测量图。(c)各组角分布统计。(H)再生TMJD的纤维软骨相关蛋白AGG和COL-1表达的蛋白质印迹分析。

 

图7.植入16周后髁突的显微CT评估。(A,B)骨体积/总体积(BV/TV)和平均小梁间距(Tb.Sp)的定量统计,(每组n=3,平均值±标准差;与假手术组相比,*P<0.05;与原生组相比,#P<0.05)。(C)每组髁突的代表性显微CT截面图像。上排和下排分别为髁突的矢状面和冠状面。比例尺:1mm。